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国民党反动派争夺统一战线的领导权，叛变革命，1927年4月18日蒋介石在南京成立了代表大地主、大资产阶级利益的国民政府，大肆屠杀共产党人和革命群众。陈独秀奉行投降主义路线仍然未变，因此遭到党的绝大多数干部的不满。共产国际提出改组中共中央、武装工农、实行土地革命。1927年7月12日，中共中央由张国焘、李维汉、周恩来、李立三、张太雷组成中央临时常务委员会，陈独秀从此离开了中央最高领导岗位。
在革命的紧要关头，临时中央接受李立三的建议，独立发动反抗国民党反动统治的武装起义。那时中国共产党所掌握的武装力量，主要集中在张发奎统率的国民革命军第四集团军第二方面军中，其中包括共产党人叶挺指挥的第十一军第二十四师，以叶挺独立团为主干编成的第四军第二十五师的第七十三团、第七十五团，由接近共产党的贺龙[南昌起义后参加了共产党]指挥的第二十军。在南昌，还有原由朱德指挥的受共产党影响的第五方面军第三军的军官教育团和南昌公安局的保安部队。7月27日，周恩来到达南昌，根据中央的决定，组织南昌起义，成立中共前敌委员会。前敌委员会由周恩来、李立三、恽代英、彭湃组成，周恩来任书记。7月30日，张国焘以中共中央代表的身份来到南昌。在当天的前委会议上，张国焘提出起义需要征得张发奎的同意，并称这是共产国际代表的意见。此时的张发奎在第二方面军中“清党”之举已经昭然若揭，对其再存有幻想是错误的。前委认为如果征得张发奎同意后再起义，就等于取消起义，因此否决了张国焘的意见。7月31日，前委决定8月1日举行南昌起义。
8月1日凌晨，在以周恩来为首的前敌委员会领导下，贺龙、叶挺、朱德、刘伯承等率领在党直接掌握和影响下的军队2万余人，举行南昌起义。经过四个多小时的激烈战斗，起义军全歼守敌3000余人，占领南昌城。聂荣臻、周士第在南昌附近的马回岭举行起义，8月2日赶到了南昌。
为了争取和团结国民党中一部分愿意继续革命的人士，揭露蒋介石和汪精卫背叛孙中山革命精神的面目，这次起义仍是用国民党左派的旗帜。起义胜利后的当天，成立了由宋庆龄、邓演达[二人未到南昌]、周恩来、贺龙等25人组成的中国国民党革命委员会，以宋庆龄的名义发表《中央委员会宣言》，指出南京的蒋介石和武汉的汪精卫曲解三民主义，背叛国共合作，毁弃联俄联共扶助农工的三大政策，已经成了孙中山事业的罪人，号召一切革命者团结一致，继承孙中山的革命遗志，“继续为反对帝国主义与实行解决土地问题而奋斗”。起义部队沿用国民革命第二方面军的番号，下辖第九、第十一、第二十军共三个军。第九军军长韦杵、副军长朱德[不久继任军长]，党代表朱克靖；第十一军军长叶挺、党代表聂荣臻；第二十军军长贺龙，党代表廖干吾。革命委员会任命贺龙为国民革命军第二方面军代总指挥，叶挺为前敌总指挥。
8月3日，起义军按原计划撤离南昌，南下广东，以期恢复广东根据地，并占领出海口，取得国际援助，然后重新北伐。但是这时的国民革命军大部分已经转到反革命一面，共产党领导的南昌起义部队势单力薄，不可能像北伐时期那样，重新进行以占领城市为中心目标的革命战争。起义军南下广东，劳师远征，与围追堵截的国民党军队多次交火，加上天气炎热，损失严重，在中途不得不分散行动。1927年10月，南昌起义主力部队在敌人优势兵力的围攻中遭到严重失败。其中一小部分转入海丰、陆丰地区，与当地农民军会合后开展斗争。朱德、陈毅带领的起义军，转入粤赣湘边界地区，开展游击战争。起义失败后，周恩来等领导人辗转到了香港，经过总结经验教训，决定起义军的余部就地与农民结合，在农村开展武装斗争。
南昌起义打响了武装反对国民党反动派的第一枪，用血与火的语言，宣告中国共产党人不畏强暴、坚持革命的坚强决心，在全国人民面前树立了一面革命旗帜，标志著中国共产党独立地领导革命战争、创建人民军队和武装夺取政权的开始，因而具有重大历史意义。
1933年7月，中华苏维埃共和国临时中央政府通过决议，指出中国工农红军是由南昌起义开始组建的，因此“批准中央革命军事委员会的建议，规定以每年‘八一’，为中国工农红军纪念日”。这就是8月1日成为中国人民解放军建军节的由来。